2. 材料与方法 本研究使用的香榧树种植在浙江省杭州市临安的香榧果园。在假种皮突出后30 d（约5月），对球果进行瞬时过表达实验。 2.2. 采用冻融法 将pCAMBIA1300-GFP空载体转化为农杆菌GV3101菌株。阳性克隆在含有50 mg/L卡那霉素和50 mg/L利福平的YEB液体培养基中培养，28℃，220 rpm摇培养至600 nm光密度（OD）为0.6。将细胞离心后重悬于农杆菌浸润缓冲液（10 mM MgCl2, 10 mM MES, 100 μM - tosyringone, pH 5.6）中，用1 mL超细针注射器将含有上述质粒的10 μL农杆菌细胞悬液注射到巨锥细胞中。通过分析液体注射培养基中细菌密度（0、0.1、0.3、0.6和0.9 OD600值）和孵育时间（0、3、6和9 d）等参数，探讨影响基因过表达瞬时转化效率的因素。每次实验大约使用50个锥体。 2.3. 切割注射了pCAMBIA1300-GFP的T. grandis锥体，轻轻置于载玻片上，立即用共聚焦激光扫描显微镜（LSM880，蔡司，德国）观察，激发波长为488 nm。为了进行亚细胞定位分析，我们将TgWRKY47的编码序列（CDS）（不包括停止密码子）整合到表达载体pCAMBIA1300-GFP中。然后通过冻融法将这些重组载体转化为根癌农杆菌菌株GV3101 (Liu et al., 2023)，然后将其瞬时导入大农杆菌球果中。孵育120 h后，用一次性锋利刀片将表达的组织尽可能薄地切在沾有水滴的显微镜载玻片上直接观察。然后在共聚焦激光扫描显微镜（LSM880，蔡司，德国）下检测信号，激发在488 nm，发射在507 nm （GFP）或激发在587 nm，发射在610 nm （mCherry）。 2.4. 用12% SDS-PAGE进行蛋白分离。将SDS-PAGE凝胶转移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，用5%脱脂奶粉阻断至少3小时，然后在4℃下与抗gfp（1:2000，小鼠，Abmart生产）和抗actin（1:5000，小鼠，Abmart生产）一抗孵育过夜。用PBST洗涤（三次）后，将膜与马萝卜过氧化物酶（HRP）偶联二抗（1:5000，产自山羊，Abmart）在室温下孵育2小时。使用化学发光成像（Tanon 5200 Multi，中国）分析信号。 2.5. 采用RNAprep Pure Plant Kit （Tiangen, China）从大叶菊球果中分离总RNA （RT-qPCR）。在CFX96 Touch Real-Time PCR系统（Bio-Rad）上使用SYBR Green Real-Time PCR Master Mix （Toyobo, Japan）进行RT-qPCR检测基因表达水平。RT-qPCR中TgWRKY47或GFP特异性引物对采用PRIMER3 (v.0.4.0) （http://bioinfo.ut.ee/primer3 -0.4.0 /）设计，见表S1。按照（Yan et al., 2023）的描述进行RT-qPCR扩增。TgWRKY47或GFP在大田鼠球果中的表达水平与TgActin的表达水平归一化。通过2−ΔΔCT方法计算相对基因表达水平（Livak和Schmittgen， 2001）。 2.6. 组织学观察将瞬时过表达TgWRKY47或空载体的球果沿其中部横切。然后将所得横切面在FAA溶液（50%酒精：乙酸：甲醛溶液= 87:3:10）中固定过夜。随后，样品用乙醇系列脱水，并包埋在石蜡中。切片至8 μm厚，用藏红花o -实绿染色，用Olympus BX60显微镜（Olympus, Japan）观察并拍照 。2.7. 统计分析所有结果均以至少三个重复的平均值±SD报告。实验数据采用SPSS统计软件20.0进行单因素方差分析。p值< 0.05认为有统计学意义。