转录组数据量化指标详解
一、前言
在转录组分析中，Reads、Count、RPK、RPKM、TPM、CPM等指标用于量化基因表达。本文结合实际案例，解析各指标的计算公式、计算实例及使用范围，帮助理解其应用逻辑。
二、指标解析
（一）Read
- 定义：在单端测序中，Reads指测序生成的短序列（reads）成功比对到目标基因（或转录本）的数量。如图中绿色短序列，若为单端测序，统计比对到基因外显子区域的这些序列数量，即为对应基因的 Reads 数。
- 使用范围：作为单端测序的原始量化数据，仅反映基因在单端测序中的被检测情况。由于未标准化，其数值易受基因长度（长基因更易获得更多 Reads）和测序深度影响，仅适用于同一样本内的简单比较（如技术重复间的初步观察），无法直接用于跨样本或复杂的表达差异分析。
说人话就是，有多少片段 map 到了基因上边
（二）Count
- 定义：针对双端测序，Count表示比对到目标基因（或转录本）的片段数量。双端测序会产生一对末端序列（reads 对），每成功比对到基因上的一对片段，计为 1 个 Count。如图中若为双端测序模式，统计比对到基因区域的片段对数，即为该基因的 Count 值。
- 使用范围：作为双端测序的原始计数数据，是后续标准化分析（如计算 FPKM、TPM 等）的基础输入。但未标准化的 Count 同样受基因长度和测序深度干扰，不能直接用于跨样本比较或差异分析，需通过 RPKM、TPM 等方法标准化后，才能准确评估基因表达水平。
接下来，看一张图，就全部明白了，但是首先，我们要知道如何定义一个基因的长度
基因长度的定义
| 方法 | 描述 | 适用场景 |
|---|---|---|
| a. 基因最长的转录本长度 | 选取基因所有转录本中长度最长的转录本 | 转录本差异大且最长转录本主导表达的基因 |
| b. 多个转录本长度的平均值 | 计算基因所有转录本长度的平均值 | 转录本表达均衡的基因 |
| c. 非重叠外显子长度之和（L1+L2+L3+L4） | 将基因外显子区域（不含内含子）的非重叠部分长度相加 | 常用方法，聚焦成熟mRNA编码区域 |
| d. 非重叠 CDS 序列长度之和 | 仅计算基因编码蛋白质的 CDS 区域非重叠部分长度总和 | 关注蛋白质编码的表达分析 |
这里我们选择 c 作为一个基因的长度
说人话就是 Counts 就是一个 Gene 的所有 Reads
（三）RPK（Reads Per Kilobase）
\( RPK_i = 10^3 \cdot \frac{n_i}{l_i} \) （\(n_i\)为基因Counts，\(l_i\)为基因长度，单位kb）
实例
| 基因 | Sample1 (counts) | 基因长度 | Sample1 (RPK) |
|---|---|---|---|
| Gene A (2kb) | 8 | 2 kb | \(10^3 \cdot 8/2000 = 4\) |
| Gene B (1kb) | 6 | 1 kb | \(10^3 \cdot 6/1000 = 6\) |
（四）RPKM（Reads Per Kilobase of transcript per Million mapped reads）多用于单端测序
\( RPKM_i = 10^9 \cdot \frac{n_i}{l_i \cdot \sum_j n_j} = 10^6 \cdot \frac{RPK_i}{\sum_j n_j} \) （\(\sum_j n_j\)为样本总Counts）
实例
| 基因 | Sample1 (counts) | Sample2 (counts) | Sample1 (RPKM) | Sample2 (RPKM) |
|---|---|---|---|---|
| Gene A (2kb) | 8 | 16 | \(0.4 \cdot 10^6\) | \(0.1 \cdot 10^6\) |
| Gene B (1kb) | 2 | 64 | \(0.2 \cdot 10^6\) | \(0.8 \cdot 10^6\) |
以Sample1的Gene A为例： \( RPKM_1 = 10^9 \cdot \frac{8}{2000 \cdot (8 + 2)} = 10^6 \cdot \frac{4}{8 + 2} = 0.4 \cdot 10^3 \)
（五）TPM（Transcripts Per Million）
\( TPM_i = 10^6 \cdot \frac{RPK_i}{\sum_j RPK_j} = 10^6 \cdot \frac{n_i/l_i}{\sum_j (n_j/l_j)} \)
实例
| 基因 | Sample1 (counts) | Sample2 (counts) | Sample1 (TPM) | Sample2 (TPM) |
|---|---|---|---|---|
| Gene A (2kb) | 8 | 16 | \(0.667 \cdot 10^6\) | \(0.111 \cdot 10^6\) |
| Gene B (1kb) | 2 | 64 | \(0.333 \cdot 10^6\) | \(0.889 \cdot 10^6\) |
以Sample1的Gene A为例： \( TPM_a = 10^6 \cdot \frac{8/2000}{8/2000 + 2/1000} \approx 0.667 \cdot 10^6 \)
（六）CPM（Counts Per Million）
\( CPM_i = 10^6 \cdot \frac{n_i}{\sum_j n_j} \)
实例
| 基因 | Sample1 (counts) | Sample2 (counts) | Sample1 (CPM) | Sample2 (CPM) |
|---|---|---|---|---|
| Gene A (2kb) | 8 | 16 | \(0.8 \cdot 10^6\) | \(0.2 \cdot 10^6\) |
| Gene B (1kb) | 2 | 64 | \(0.2 \cdot 10^6\) | \(0.8 \cdot 10^6\) |
以Sample1的Gene A为例： \( CPM_a = 10^6 \cdot \frac{8}{8 + 2} = 0.8 \cdot 10^6 \)
三、总结
| 指标 | 计算核心逻辑 | 适用比较场景 |
|---|---|---|
| RPK | 基因长度标准化 | 单样本内基因比较 |
| RPKM | 基因长度+测序深度标准化（单端） | 样本内比较，早期跨样本 |
| TPM | 基因长度+测序深度标准化（全局） | 组内+组间比较，差异分析 |
| CPM | 测序深度标准化 | 组间比较，低表达基因筛选 |
通过理解各指标的计算逻辑与适用范围，结合实际案例分析，可在转录组研究中更精准地选择量化指标，提升分析结果的可靠性。