1、取材:完整植株拍照(使用体式显微镜),取材时在图片相应的位置标注编号。
2、固定:将取好的材料放入5ml离心管中,倒入5ml左右的FAA固定液,固定2一3天。
3、脱水:提前配制50%、70%、80%、90%、95%浓度的酒精。回收FAA固定液,向离心管中加入50% 酒精,处理20 min(这一步可以省略),换70%的酒精,过夜(12-24 h ) → 80% → 90% → 95 % → 100% → 100% → 各15min(推荐5-15min)
4、透明:二分之一二甲苯二分之一酒精→纯二甲苯→纯二甲苯→各1h。
5、浸蜡:
低温浸蜡(37℃):倒掉二甲苯,重新加入4ml左右的二甲苯,并向离心管中连续加入适量碎蜡(注意观察石蜡溶解的情况),直至石蜡不溶解,然后将离心管放入37℃烘箱中,过夜。在放入烘箱前期需要不定时观察石蜡溶解的情况,若离心管中石蜡再次溶解完全,可再次加入碎蜡。
高温浸蜡(56-60℃):提前打开水浴锅,设置一个水浴锅温度为65-70℃,用于溶蜡,再设置另一个水浴锅温度为60℃,用于高温浸蜡。将二甲苯与石蜡混合物倒出,将材料从离心管中转移到新的离心管中,倒入溶蜡,将装有材料离心管放入水浴锅中,水浴1h。1h后换新溶蜡,再水浴1h。
6、包埋:提前准备包埋盒、镊子、酒精灯、打火机、石蜡回收瓶。先点燃酒精灯,将模具(包埋盒)和镊子放于酒精灯上预热,倒入提前溶好的石蜡,用镊子夹出材料放于模具中,在模具底层出现凝结时,调整材料的位置(横切/纵切),及时做好标记。静置等待石蜡凝固。(若发现镊子上的石蜡开始凝固,可放于酒精灯上加热一下。)
7、切片:提前预约切片机并准备好载玻片、记号笔、热水、大烧杯、温度计、镊子及一个大一点的盒子。打开机器开关,安装刀片,固定蜡块,调整刀片与蜡块的距离,开始切片。一边切片一边用毛笔调整蜡带的位置。当切出有材料的蜡片时,用镊子夹出蜡片,放于42摄氏度左右的水浴中展片,并用载玻片将其捞起,做好标记,放置一旁干燥。
8、烘片:将有材料的载玻片放置于37摄氏度的烘箱中进行烘片,烘片1-3天。
9、脱蜡复水:将烘片完成的载玻片放入染色缸,进行脱蜡,纯二甲苯10min →二分之一纯二甲苯二分之一酒精5min →100% → 95% → 90% → 80% → 70% → 50% →水各5 min,逐级进行脱蜡复水。
10、染色:番红为1%的水溶液,固绿为0.5 %的酒精溶液(酒精用95%的酒精配制)
番红染色4-6h,然后用水洗掉多余的番红溶液→ 50% → 70% → 80% → 90% → 95%各10 min →固绿10-40 s → 95% 洗一下→ 100% →二分之一二甲苯二分之一酒精→二甲苯各5min →中性树胶封片。
封片后镜检。end
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