打前准备：

1. 甘油菌小摇大摇后离心8min——将菌液倒掉留下菌
2. 配置悬浮液：（注意和小孢子的不一样）300ml重悬液体系：6ml 0.5mol/L MES（调PH5.6） ,600ul 0.1mol/LAS,3mlMgcl2,ddH2O，提前配置AS,MES提前拿出来泡水里，因为AS难融
3. 然后导入和大摇一样量的悬浮液，如果菌不多应该少倒一点
4. 涡旋，使用涡旋机将其涡旋起来
5. 测OD值：大孢子查看文献的话OD值为0.6较好，但应根据实验所需，0.8也可以
6. 如若OD值较小则进行刮板，将菌刮下来，如果板子在超净台外打开的话就不能用了，所以尽量涂板的时候涂两个以备用；如果OD值较大的话应加入悬浮液
7. 调到一定值就可以打了
8. 为避免前期小摇大摇没有摇起来，应在其同时进行涂板，涂板和小摇大摇时间一样，所以同时进行即可，这样即使没有摇起来菌也可以进行刮板，1300应多准备
9. 工具的准备：标签，笔，0.3针头，针管，手套，板架（针头多准备，大孢子容易堵）

打大孢子：

1.找一致性较好的膨大孢子，并写标签，挂标签

注：ａ．标签名称：基因名字—第几对—CK／OE—左／右／上／下＋日期＋自己名字

　　ｂ．并在大孢子上标CK／OE

２.打之前拍照

注：ａ．大孢子与标签平齐，并在一个平面上，

　　ｂ．CK和OE分别各一张，并使标签与相对性的大孢子靠近拍

３.打之前将针头换成我们的黄色针头，并在针管壁上标好对应基因以免混搅

４.针头对准大孢子尖端的突起位置进行注射，先将针头完全插入，然后沿注射进去的通路来回动一动后推溶液

５.可以先打一下试试手，如果针头经常堵得话，可以专门用一个固定的针头先疏通一下，再沿

一样的位置打可能会好些

６.建议一人找大孢子，挂标签，一人专门打，这样比较快，且为了尽可能的一致性，建议专门一人打，固定的搭配

７.打的时候不要打进去太多，因为大孢子与小孢子不同，使密闭的空间，打的多了里面会砰的一声炸掉

８.打完后记录树的编码以及基因和对数

过十天后采摘

1. 准备镊子，小的塑封袋进行采摘
2. 一对一对的装进袋子里

摘完后拍照

1. 摘回来后应尽早进行处理
2. 拍照：在摄影棚中进行，摆上信息卡片、方便识别的蓝色卡片，对应的挂在树枝上的黄色标签，尺子以及CK、OE对应的大孢子（如图）尽量用同一个设备拍照

1. 拍完后，将其用刀片纵切，然后将黄色假种皮包裹的白色种胚切下来，装入写好标号的试管内，放入液氮中，保存至-80冰箱里
2. 如果切开有下图所示的或者变红，则是被打坏了应和对应标签拍下后将这组数据剔除