背景

这个工作2022年发在Molecular Plant，有Xing Wang Deng院士挂面，问题不大。

标题是

Two haplotype-resolved, gap-free genome assemblies for Actinidia latifolia and Actinidia

chinensis shed light on the regulatory mechanisms of vitamin C and sucrose metabolism in kiwifruit。

也就是说，他组装了两个单倍型级别的参考基因组。

结果部分

DH与KY的差异表达等位基因

等位基因差异表达对生存和生长具有关键作用，可导致表型多样性与进化。为在全基因组水平鉴定果实发育过程中呈现等位基因特异性表达（ASE）的基因，本研究分别对DH（29套）和KY（30套）RNA-seq数据集（附表1、附图13）进行等位基因水平定量分析（方法部分）。

首先将转录组读段比对至单套染色体组。即使经过严格筛选唯一比对读段，仍发现大量基因呈现"参考基因组主导"现象（数据未展示）。为避免参考基因组偏好性误差，后续采用宏基因组作为参照。最终定义FPKM>2且至少三个样本中ASE比率[=Hap1表达量/(Hap1+Hap2表达量)]显著的基因为ASE基因。

在33,759对DH同源基因中鉴定出4,687个ASE基因，KY的34,502对基因中鉴定出12,237个。绝大多数ASE基因（92.50%，DH-4,375个/KY-11,280个）持续偏好特定单倍型表达（图5B）。偏好转换基因的表达量显著低于稳定偏好基因（附图14）。以宏基因组为参照时，单倍型1主导（DH-2,171个/KY-5,629个）与单倍型2主导（DH-2,204个/KY-5,651个）的ASE基因数量基本平衡（图5B），这些基因在基因组上呈交错分布（附图15）。

DH的4,687个ASE基因周边检测到：上游2kb区（每100bp1.49个SNP）、下游2kb区（1.28）、外显子（0.66）和内含子（0.91）的变异频率，均显著高于等位基因均衡表达基因（分别为1.15/1.02/0.44/0.62）。KY呈现相似模式（图5C），表明ASE基因调控区丰富的等位变异可能导致其表达偏好。

方法部分

转录组分析与等位基因特异性表达（ASE）基因鉴定

同源基因区块鉴定

通过MCScanX软件（Wang等，2012）结合基因组注释与序列信息，鉴定出DHM与DHP间的同线性基因区块，并将位于大基因区块内的基因对确定为等位基因。随后整合DHM和DHP的基因组组装与注释信息，构建宏基因组。

转录组数据比对分析

使用STAR比对工具（Dobin等，2013）将高质量转录组读段比对至宏基因组，关键参数设置如下：

• --outMultimapperOrder Random：多比对读段随机分配
• --outSAMtype BAM Unsorted：输出未排序BAM文件
• --quantMode GeneCounts：生成基因计数
• --alignIntronMax 6000：设置最大内含子长度
• --outSJfilterReads Unique：仅保留唯一比对剪切位点
• --outFilterMismatchNmax 1：允许最大错配数为1

数据后处理

1. 通过SAMtools（Danecek等，2021）对比对结果进行排序与过滤
2. 使用Picard工具去除PCR重复的唯一比对读段
3. 基于StringTie对宏基因组注释基因的读段进行计数

ASE基因筛选标准

构建所有等位基因对的表达矩阵后，筛选满足以下条件的基因：

• 总表达量＞2 FPKM
• 在至少三个样本中呈现显著ASE比率（＞0.75或＜0.25）

最终鉴定为具有等位基因特异性表达的基因。

金山文档链接

【金山文档 | WPS云文档】 ASE参考文献：猕猴桃的两个单倍型
https://www.kdocs.cn/l/coRzQj1Z1ARq