软件介绍

Primer Premier 6.0是一款功能强大的PCR引物的综合性软件。Primer Premier的搜索算法利用最近邻热力学算法（Nearest Neighbor Thermodynamic）计算最准确的解链温度，找到最佳的PCR、多重PCR和SNP基因型分型分析引物。软件会根据引物的二级结构、二聚体、发夹结构、同源性和物理性质进行筛选，并根据其性能优越性给出最佳选择并生成一个顺序。从NCBI 下载感兴趣的基因，选择搜索范围，Primer Premier会自动选择最佳引物。

软件功能

• CR引物设计 - 设计引物对用于PCR和多重实验。
• 跨物种 - 扩增来自多个物种的序列。
• 致病性检测 - 在高度保守的区域中定位寡核苷酸。
• 等位基因特异性 - 仅扩增一组相关序列中的单个成员。
• 简并 - 从氨基酸序列开始，反向翻译并自动设计低简并区域的寡核苷酸。
• 嵌套/多重 - 检查多个候选寡核苷酸之间的同源性。
• 限制酶和基序分析 - 从数据库中选择800多种酶和200种常见基序。
• Clustal W比对 - 使用任何资源（包括EBI）在执行ClustalW比对后加载比对序列。
• 多序列比对 - 使用流行的Clustal W算法来对齐桌面上的序列（仅适用于Windows版本）。
• 算法 - 使用Breslauer值计算Tm。
• 长PCR-处理最多50 KB的序

软件使用

1. 获取基因序列

访问NCBI网站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/），在搜索栏选择“Gene”数据库，输入目标基因名称和物种（如“tp53 human”），找到目标基因后点击进入详细页面。在“NCBI Reference Sequences (RefSeq)”板块中，选择对应的mRNA序列（如“NM_000546.5”），点击“CDS”获取编码序列，再选择“FASTA”格式复制序列。

1. 新建序列文件

打开Primer Premier 6，点击菜单栏“File→New→Sequence”或使用快捷键“Ctrl+E”，粘贴复制的基因序列，点击“Add”保存。

1. 设置引物参数

点击菜单栏“Analyze→Primer Search”或快捷键“Ctrl+M”，进入引物设计界面。

• 熔解温度（Tm）：一般设置为55-65℃，允许±2-3℃波动。
• 引物长度：通常为18-25bp。
• 扩增产物长度：根据实验需求设置，如100-300bp。
• 其他参数：可默认设置，或根据经验调整（如GC含量、避免二聚体等）。

1. 搜索引物

设置参数后点击“Search”，软件会自动计算并生成引物对。结果按得分排序，得分越高表示引物质量越好。可选择“Best”或“Good”等级的引物。

1. 验证引物

将设计好的引物序列复制到NCBI的Primer-Blast工具（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi）中，选择目标物种，验证引物的特异性和扩增效率。

注意事项：引物设计需结合实验目的和模板序列特点，多次调整参数以获得最佳结果。

mac用户下载链接：（先安装第一个再安装第二个）

CrossOver21 链接: https://pan.baidu.com/s/1iufZ6ROfhYaLR7taejl11w?pwd=9f8h 提取码: 9f8h

Primer 6 Mac: 链接: https://pan.baidu.com/s/14sRsg-_gqOYLLMH3-FEYsg?pwd=hdp9 提取码: hdp9