总体流程：提RNA——qPCR——定量
提前设计引物
提前约仪器荧光定量PCR仪(S2022AOGT)
- 提RNA
- 将液氮研磨成粉末的 100~200 mg 植物组织收集至 2 ml无 RNA 酶的离心管(自备)中。
- 往离心管内加入1ml65°℃ 预热的 Buffer PPR1，用移液器吹打或涡旋30-60s，充分裂解细胞，以降低粘稠度及提高得量。
- 将离心管于 65°℃水浴处理 5-10 min，期间颠倒混匀 1-2 次。
- 将裂解物 12,000 rpm 离心5 min。
- 吸取 900 ul上清至一个新离心管中,再加入 450 m无水乙醇,吹打混匀。此时可能出现沉淀，但不影响 RNA 的提取。
- 将上述溶液转移至基因组 DNA 清除柱中，12,000rpm离心1min，弃滤液。注:请分批过柱，每次上柱体积不大于750ul。
- 将基因组 DNA 清除柱置于一个 2m 无 RNA 酶的离心管(自备)内,往柱内加500ul Buffer PPR2，12,000rpm 离心1min，收集滤液(注RNA 在滤液中)，往滤液中加入 250 的无水乙醇，立即吹打混匀此时可能出现沉淀，但不影响 RNA 的提取。
- 将上述溶液加入 HiPure RNA Column 中，12,000rpm离心1min,弃滤液。
- 往柱内加入 700ulBuffer RWA,室温放置1min后12,000rpm 离心 30 s,弃滤液。
- 往柱内加入 500 ml Buffer RwB(请先检査是否已加入无水乙醇!)10.12,000rpm离心 30s，弃滤液。重复洗涤一次，弃滤液。
- 将 HiPure RNA Column 放回空收集管中，12,000rpm离心 1min，尽量除去漂洗液，以免柱中残存乙醇抑制下游酶促反应。
- 将 HiPure RNA Column 置于洁净的 1.5 ml 无 RNA 酶的离心管中，在膜中央加入 30 μ RNA Elution Buffer ，室温放置1~2 min,12,000 rpm室温离心1min，洗脱液即含RNA。
注：将 RNA Elution Buffer 加热至 65℃，可提高洗脱效率
- qPCR
1.基因组DNA去除
组分：
RNase-free ddH20 to 10 ul
5 x gDNA wiper Mix：2ul
Total RNA:10 pg - 1 ug
or Poly A* RNA:10 pg - 100 ng
用移液器轻轻吹打混匀。42° 2 min。
2. 配制第一链cDNA合成反应液
组分:
上一步的混合液：10 ul
4 x HiScript IV RT SuperMix：5ul
Oligo (dT)20VN:1ul
Random Primers:2ul
RNase-free ddH20:2ul
用移液器轻轻吹打混匀。
也可使用GSP（2pmol）进行逆转录。
3. 按下列条件进行第一链cDNA合成反应
37°C 15 min
85°C 5 sec
如果模板具有复杂二级结构或高GC区域，可将反应温度提高至50°C，有助于提高产量。
产物可立即用于oPCR反应，或在-20°C保存，并在半年内使用；长期存放应分装后在-70°C保存。GDNA应避免反复冻融。
- 定量
- 将浓度调至300：按照C1V1=C2V2，C1是CDNA的浓度，C2为300，V2为20，算出V1为应该加的前期反转录的量，再加20-V1的DEPC
- 按照以下流程加样：
M1：SYB：5ul;F1：0.2ul；R1：0.2ul；（F1R1为所做物种的引物）
M12：SYB：5ul;F2：0.2ul；R2：0.2ul；（F2R2为基因的引物）
M2：CDNA：0.4ul；DEPC：4.2ul。（M2应该横着加在对应的基因孔内）
现在1.2.3中加入M1，456中加入M12,然后横着加入M2，后离心三分钟。
- 放入定量仪器中，一般选择荧光定量PCR仪(S2022AOGT)
- 选择96...only...
- 最后跑出来一个表格，查看名为...Cq-Results的表格
- 数据合理区间：表中内参值为14-18；基因＜30
【金山文档 | WPS云文档】 荧光定量PCR实验过程
https://www.kdocs.cn/l/ckymq7E4d7Qj