一、质粒转化 K599热激法操作方法

发根农杆菌是根瘤菌科(Rhizobiaceac)农杆菌属(agrobacterium)的一种革兰氏阴性上壤细菌，它能够感染大多数双子叶植物和少数单子叶植物以及个别裸子植物。K599发根农杆菌(NCPPB2659)含有 pRi2659农杆碱型Ri质粒，具有广泛的宿主范围(葫芦科，豆科，茄科等)，同时具有链霉素抗性。

1.取-80C保存的K599发根农杆菌感受态于室温或手心片刻待其部分融化，处于冰水混合状态时插入冰中。

2.每100L感受态加入0.01-1Hg质粒DNA(转化效率较高，第一次使用前最好做预实验确定所加质粒的量)，用手快速、剧烈拨打管底混匀或用枪吹吸混匀，依次放于冰中静置5分钟、液氮5分钟、37C水浴5分钟、冰浴5分钟。

3.冰浴中拿出放室温，加入700+无抗生素的LB液体培养基，于28C振荡培养2小时。

4.6000rpPm离心一分钟收菌，留取100左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含相应抗生素的LB平板上，倒置放于28C培养箱培养2-3天。

• 硫酸卡那霉素(kan)

双蒸水溶解，0.22 pm滤膜过滤除菌 100 mg/ml

• 链霉素(strep)

双蒸水溶解，0.22 pm滤膜过滤除菌 100 mg/ml

• LB配方(IL)

胰蛋白胨10g

酵母提取物5g

氯化钠10g

补水到1L体积，完全溶解后，121度、20分钟高温灭菌

若配制LB固体培养基，则加入15g琼脂粉。

二、发根农杆菌转化操作方法

1.载体转化及发根农杆菌的制备

构建双元表达载体，以花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子驱动的eGFP基因作为报告基因，将35S::GFP-pCAMBIAI300质粒转入K599发根农杆菌菌株中。

2.发根农杆菌侵染液的制备

2.1将步骤1转入外源载体的K599发根农杆菌单菌落接种于含60mg:L硫酸卡那霉素和30mg.L'链霉素的LB液体培养基中，于28℃震荡培养至OD600值为0.6~1.0。

2.2在4℃、5000rpm.min'条件下离心10min集菌，弃上清液。

2.3将底部的菌块重悬于2-吗啉乙酸(MES)缓冲液:10mmoLL-MES,10mmol.LMgCl2，100mol.L'乙酰丁香酮，调pH值至5.2,制成发根农杆菌侵染液。

3.发根农杆菌遗传转化

3.1以豌豆幼苗为外植体，用步骤2制备的发根农杆菌侵染液，采用针刺的方法于豌豆幼苗胚轴基部进行侵染，将侵染后的幼苗种植于湿润的育苗基质中，使育苗基质完全覆盖侵染部位，在温室中避光培养2天并盖上透明育苗盖保湿。2天后正常光照，三周后观察处理部位是否诱导出毛状根，用便携式荧光激发光源筛选含有绿色荧光信号的阳性外植体并统计。温室的条件为温度25℃/20℃(昼/夜)，湿度60%，光照12h/黑暗12h，光照强度200 mol.m2.s:育苗基质为按照重量比为1:1:1的泥炭、蛭石和珍珠岩形成的混合土。

3.2以薄壳山核桃幼苗为材料，用步骤2制备的发根农杆菌侵染液，采用刀片沾菌液划割幼苗胚轴基部，在温室中避光培养2天并盖上透明育苗盖保湿。2天后正常光照，五周后观察处理部位是否诱导出毛状根，用便携式荧光激发光源筛选含有绿色荧光信号的阳性外植体并统计。培养条件和培养基质同3.1。

三、阳性根的鉴定及统计分析

因转化的发根农杆菌携带eGFP基因，可根据毛状根是否有绿色荧光来判断外源基因是否成功导入。

3.1使用便携式荧光蛋白激发光源荧光仪(Luyor-3415RG,上海,中国)筛选发出绿色荧光的阳性毛状根并统计数目,阳性毛状根比例=(阳性根的外植体数/侵染的总外植体数)x100%。借助滤光片用手机进行全株拍照。

3.2绿色荧光的阳性毛状根进一步使用宏观变倍体视荧光显微镜(蔡司AxioZoom.V16)进行局部拍照。