01 需要准备的文件

1. gff文件（如果有的话，最好是gtf文件，gtf文件格式更严谨）
2. 基因组文件
3. vcf文件

02  利用annovar进行SNP注释

（1）准备基因组文件构建数据库

• 下载gffread：将gff文件转化为gtf文件

  # 版本为为gffread v0.12.8
  git clone https://github.com/gpertea/gffread
  cd gffread
  make release

• 将gff文件转换为gtf文件

  # gff转换为gtf
  gffread Rmolle_genomic_GCA_025413875.1.gff -T -o Rmolle.gtf

• 将gtf文件转成refGene格式

  # 利用conda下载gff3ToGenePred
  
  conda create -n ucsc -c bioconda ucsc-gtftogenepred
  conda activate ucsc
  
  	
  # 转gtf成refGene格式
  gtfToGenePred -genePredExt Rmolle.gtf Rmolle_refGene.txt

• 提取序列文件

  retrieve_seq_from_fasta.pl --format refGene --seqfile Rmolle_genomic_GCA_025413875.1.fasta -outfile Rmolle_refGeneMrna.fa Rmolle_refGene.tx

（2）SNP注释

• 参考：https://blog.csdn.net/qq_42756195/article/details/108545715?utm_medium=distribute.pc_relevant.none-task-blog-2~default~baidujs_baidulandingword~default-0-108545715-blog-139204318.235^v43^pc_blog_bottom_relevance_base8&spm=1001.2101.3001.4242.1&utm_relevant_index=3
• 参考：https://blog.csdn.net/qq_64400864/article/details/139204318
• 主要包含三种不同的注释方法：gene-based, region-based 和filter-based。基于基因的注释（Gene-based Annotation）揭示variant与已知基因直接的关系以及对其产生的功能性影响，基于区域的注释（Region-based Annotation）揭示variant 与不同基因组特定区域的关系，例如：它是否落在转录因子结合区域等，基于筛选的注释（Filter-based Annotation）则分析变异位点是否位于指定的数据库中，比如dbSNP, 1000G，ESP 6500等数据库。
• annovar 注释之前需要对文件格式进行转换，也可以使用vcf文件作为输入文件，只需要使用-vcfinput。
• table_annovar.pl和convert2annovar.pl都可以注释，并且table_annovar.pl可以一次性完成三种注释。但是自建库只能进行gene-based的注释。
• 需要注意的是，在使用convert2annovar.pl转换格式时，会有一个QC过滤的过程，所以建议使用该程序进行过滤和格式转换。

# 1.转换格式
## convert2annovar.pl转换格式
convert2annovar.pl -format vcf4 -allsample -withfreq all.clean.indel.vcf.gz > all.clean.indel.annovar.input

# 2.进行annovar注释

## 这部分内容为脚本测试
### 测试table_annovar.pl 和 annotate_variation.pl脚本有无区别（因为有看到教程说，如果是自己构建的数据库，则只有基于基因的注释类型能用；而table_annovar.pl一次性跑三个注释类型，也没有什么用）
### annotate_variation.pl脚本，--neargene 1000设置为1000，因为table_annovar.pl脚本默认的是1000
/home/software/annovar/annotate_variation.pl -geneanno --neargene 1000 -buildver Rmolle -dbtype refGene -outfile genome.indel1000.anno -exonsort  genome.indel.vcf.annovar.input ./
### table_annovar.pl脚本
/home/software/annovar/table_annovar.pl genome.indel.vcf.annovar.input ./ -buildver  Rmolle --outfile genome.indel1000.table.anno -remove -protocol refGene   -operation g  -nastring .   -csvout
### 结果，两个任务跑出来的文件大小一致

## 选择annotate_variation.pl脚本进行注释，因为--neargene 可以设置为2000，范围更广
annotate_variation.pl -geneanno --neargene 2000 -buildver Rmolle -dbtype refGene -outfile genome.indel.anno -exonsort  genome.indel.vcf.annovar.input ./

annotate_variation.pl -geneanno --neargene 2000 -buildver Rmolle -dbtype refGene -outfile genome.snp.anno -exonsort  genome.snp.vcf.annovar.input ./

03 结果统计

1. 变异位点分布在基因组上的位置

   less -NS XXX.variant_function | cut -f 1 | sort | uniq -c

   

2. 变异位点的类型

   less -NS XXX.exonic_variant_function | cut -f 2 | sort | uniq -c

   

至此，SNP鉴定工作完成！！！