（一)蔗糖通过TgNGA1-TgWRKY47-TgEXPA2模块参与调控香榧球果膨大
一、基因
TgEXPA2；TgWRKY47；TgNGA1
二、实验
1.TgEXPA2
q-PCR：膨大阶段、蔗糖处理、不同品种表达量检测
香榧球果瞬时过表达：农杆菌注射，验证促进细胞扩张、球果变大
番茄稳定遗传转化：过表达使番茄果实细胞变大
亚细胞定位：定位于质膜
转录组差异表达：蔗糖诱导上调，与膨大正相关
2.TgWRKY47
酵母单杂交；EMSA；qPCR；双荧光素酶报告；香榧瞬时过表达：亚细胞定位；蛋白表达检测
3.TgNGA1
酵母双杂交；荧光素酶互补；qRT-PCR
三、生信分析
1.RNA-seq转录组测序
2.差异表达基因分析
3.聚类
4.基因功能注释
5.FPKM表达量计算
6.启动子顺式元件分析
7.基因-表型关联分析
8.蛋白互作网络分析
四：结论：
1.蔗糖是关键信号：蔗糖可显著促进香榧球果增大与细胞扩张，13C标记证实光合同化物向球果高效分配，且蔗糖信号而非代谢产物起主导作用。
2.TgEXPA2正向调控细胞扩增：扩张蛋白基因TgEXPA2受蔗糖强烈诱导，在香榧球果瞬时过表达、番茄稳定过表达均能促进细胞膨大，是球果增大的关键功能基因。
3.TgWRKY47直接激活TgEXPA2：WRKY转录因子TgWRKY47可直接结合TgEXPA2启动子的W-box元件，正向激活其转录，且自身表达与蛋白水平不受蔗糖调控。
4.TgNGA1负向抑制通路：NGATHA转录因子TgNGA1与TgWRKY47直接互作，抑制其DNA结合能力，进而降低TgEXPA2转录；TgNGA1随球果增大表达下调，解除抑制。
5.完整调控模块蔗糖通过TgNGA1–TgWRKY47–TgEXPA2模块调控香榧球果增大：蔗糖升高→TgNGA1下降→解除对TgWRKY47的抑制→TgEXPA2上调→细胞扩张→球果膨大。
(二）香榧WRKY基因家族在种子发育过程中的基因组与转录组分析
一、基因
香榧全基因组WRKY家族基因
TgWRKY25
二、实验
1.67个WRKY家族基因
生物信息学鉴定：全基因组范围筛选、分类、结构分析
表达谱分析：种实不同发育时期表达模式
qPCR验证：挑选部分WRKY基因做表达量验证
2.TgWRKY25（核心功能基因）
qPCR：种实发育不同时期表达量检测
表型关联分析：表达量与种实长度、宽度、单粒重显著相关
WGCNA模块归属：归入与大小正相关的红色模块
功能预测：参与淀粉/蔗糖代谢通路
三、生信分析
1.香榧全基因组WRKY基因鉴定
2.系统进化树构建
3.基因结构分析
4.保守基序分析
5.染色体定位分析
6.转录组数据分析
7.差异表达分析
8.WGCNA加权基因共表达网络分析
9.GO功能富集分析
10.KEGG通路富集分析
11.启动子顺式作用元件分析
12.基因表达模式聚类分析
四、结论：
1.家族鉴定：香榧基因组中鉴定出78个TgWRKY基因，分为3个类群，分布于8条染色体，均含保守WRKY结构域。
2.结构特征：基因结构多样，内含子0-8个、外显子1-9个，家族进化分化明显。
3.表达模式：78个基因在根、茎、叶、种子中组织特异性表达；种子发育过程中43个TgWRKY表达，20个显著上调。
4.核心调控基因：TgWRKY25与种子大小、发育高度相关，归属于调控种子发育的红色共表达模块。
5.调控通路：TgWRKY25关联基因显著富集于淀粉与蔗糖代谢、内质网蛋白加工等通路，参与香榧种子发育调控。
（三）
一、研究内容
蔗糖转化酶，细胞质蔗糖转化酶和液泡蔗糖转化酶，蔗糖合成酶
二、实验
1.分子实验
qPCR：检测香榧种实膨大不同时期的表达量
表达模式分析：明确在膨大关键期（30–60d）显著高表达
与表型关联：表达水平与种实横径、纵径、鲜重正相关
2.生理实验
蔗糖、葡萄糖、果糖、淀粉含量测定；蔗糖代谢相关酶活性测定；种实形态指标测定：横径、纵径、鲜重
三、生信分析
基因表达模式聚类
基因–表型相关性分析
蔗糖代谢通路关联分析
基因表达量FPKM/相对定量统计与可视化
四、结论：
糖代谢分化：假种皮表现为“蔗糖积累→分解供能”模式，种仁则以“蔗糖分解→淀粉合成”为主。
关键酶作用：蔗糖转化酶是假种皮蔗糖水解的核心驱动酶，其活性在膨大期显著上升；种仁淀粉合成酶（SSS、GBSS等）在后期高表达。
糖运输保障：蔗糖转运基因（SBP、SUT）持续上调，保障假种皮与种仁间的糖分配。
激素协同调控：GA、IAA等激素与糖代谢酶活正相关，协同调控种实膨大与干物质积累。
（四）代谢组、转录组与功能联合分析揭示关键基因参与树龄诱导的香榧坚果氨基酸积累
一、基因
TgPK、TgWRKY21、氨基酸合成通路16个关键基因（TgGAPDH、TgALT、TgPFK、TgALDO、TgIMS、TgIPMI、TgilvA、TgASNS、TgargAB等）
二、实验
1.TgPK
qRT-PCR、丙酮酸激酶活性测定、烟草瞬时过表达、系统进化树+序列比对、启动子元件分析
2.TgWRKY21
共表达关联分析、双荧光素酶实验、酵母单杂交Y1H
3.16个氨基酸合成基因
转录组差异表达分析、qRT-PCR验证、基因–代谢物关联分析
4.整体表型与生理实验
坚果表型测定、代谢组、丙酮酸激酶酶活测定、氨基酸含量测定
三、生信分析
1.转录组RNA-seq分析
2.差异表达基因分析
3.代谢组分析
4.转录组+代谢组联合分析
5.KEGG通路富集
6.WGCNA共表达网络
7.启动子顺式元件分析
8.系统进化分析
9.保守结构域分析
10.表达量聚类与可视化
四、结论
1.表型与代谢差异
千年老树香榧种子的长度、宽度、单粒重显著高于10年幼树；代谢组显示老树种子18种氨基酸及其衍生物显著富集，其中组氨酸、谷氨酸、色氨酸、丝氨酸升高最明显，是营养与风味提升的核心物质。
2.转录组关键基因
转录组筛选到16个氨基酸合成关键基因在老树中高表达，富集于氨基酸生物合成、丙酮酸代谢通路；其中TgPK（丙酮酸激酶）是核心调控基因，与氨基酸含量强相关。
3.核心基因功能验证
TgPK在老树种子中表达量与酶活性均显著更高；
烟草瞬时过表达TgPK可提高丙酮酸激酶活性，并增加组氨酸、色氨酸、丝氨酸含量；
TgWRKY21通过直接结合TgPK启动子，正向调控其表达。
4.调控通路总结
树龄→TgWRKY21→激活TgPK转录→提升丙酮酸激酶活性→促进氨基酸合成与积累→香榧种子营养与品质提升。
（五）TgRAV1–TgWRKY74–TgACS13module fine-tunesethylene biosynthesis to modulate waterlogging-induced root vitality in the gymnospermTorreyagrandis
1.基因：TgRAV1、TgWRKY74、TgACS13
2.实验
TgACS13：qRT-PCR；功能验证；启动子结合验证
TgWRKY74：Y1H、EMSA、qPCR；双荧光素酶；BiFC、Pull-down
TgRAV1：Y1H、EMSA、ChIP；双荧光素酶；BiFC
整体实验:涝害处理、根系活力测定;乙烯含量测定
烟草瞬时转化;亚细胞定位
3.生信分析
转录组RNA-seq、差异基因分析;启动子顺式元件分析
基因共表达网络;系统进化分析;蛋白互作网络预测
四、结论：
1.涝害胁迫诱导香榧根系乙烯积累，TgACS13作为乙烯合成关键限速基因，正调控根系活力，提升香榧耐涝性。
2.TgWRKY74直接结合并激活TgACS13启动子，正向促进乙烯合成与根系活力；TgRAV1直接结合并抑制TgACS13启动子，负向调控该过程。
3.TgRAV1与TgWRKY74直接互作，抑制TgWRKY74的DNA结合能力，进一步精细下调TgACS13表达。
4.涝害通过上调TgWRKY74、下调 TgRAV1，解除抑制并激活TgACS13，最终形成TgRAV1–TgWRKY74–TgACS13调控模块，维持香榧根系活力。
（六）
一、基因
1.香榧WOX基因家族共17个基因
2.TgWOX2、TgWOX8A、TgWOX8B、TgWOX9A、TgWOX9B、TgWOX13A、TgWOX13B、TgWOX13C、TgWOX13D
二、实验
1.17个WOX家族基因
蛋白理化性质分析、亚细胞定位预测、保守基序分析、保守结构域分析、染色体定位分析
2.重点9个基因
qRT-PCR实时荧光定量、检测在根、茎、叶、愈伤、体细胞胚中的表达量、表达模式分析、筛选在愈伤、体细胞胚中高表达的关键基因、统计分析、检验不同组织表达差异显著
三、生信分析
1.全基因组范围WOX基因鉴定
拟南芥WOX序列比对香榧基因组、NCBI结构域筛选、多序列比对与系统进化分析、MEGA构建进化树、保守基序分析、保守结构域分析、染色体定位与可视化、蛋白理化性质预测、转录水平表达模式分析
、组织表达差异统计
四、结论：1.从香榧基因组中鉴定出17个WOX家族基因，按进化关系3个分支，各分支具有特异保守基序与结构域。
2.17个TgWOX基因分布在6条染色体上，蛋白均为疏水不稳定蛋白，多数定位于细胞核。
3.TgWOX2、TgWOX8B、TgWOX9A、TgWOX13A-D在体细胞胚和愈伤组织中高表达。
4.推测这些关键WOX基因参与香榧愈伤形成与体细胞胚发育，可作为体细胞胚发生调控的候选基因。
5.本研究为香榧体细胞胚再生、快速繁育与基因工程育种提供了基础。
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