步骤一：菌体收集与重悬

操作：不按照说明书走，用自己提前摇好的菌，12,000 rpm离心1分钟，彻底弃尽上清。加入200 μL预冷的Buffer P1（这一步骤的Buffer P1使用前需按说明书加入RNase A，且p1务必要放在四度冰箱，从四度取回，用完再放回四度），涡旋振荡，使沉淀溶于P1，会呈浑浊状。

步骤二：碱性裂解（最需谨慎的步骤）

操作：加入200 μL新配制的Buffer P2，立即温和地上下颠倒离心管6-8次，使内容物充分混合，溶液变得清亮、粘稠。（p2加入后应该确保在五分钟内做下一步，如果说和我一样一次提很多质粒，可以全部把盖子打开后，再挨个加，而且如果做很多管的话，建议分俩次来提，这样时间会稍微充裕些，加完p2一俩分钟就会有变化了）。

步骤三：中和与沉淀

操作：加入200 μL的Buffer P3，立即温和地上下颠倒6-8次，此时会出现白色絮状沉淀。室温下12,000 rpm离心10分钟，使蛋白-基因组DNA复合物沉淀结实。

注意：仅供参考（说明书上的一管是1.5-2ml的管来着，师姐他们之前是10毫升的管做来着，我用的是50ml离心管装的20ml的菌液，师姐看菌液量确实很多，所以我们的前面这三步的步骤加的试剂都是翻倍的量，因为如果量很多，很可能会裂解不开）

步骤四：结合、洗涤与洗脱

操作：将上清液转移至吸附柱（试剂盒内提供）中，12,000 rpm离心30秒弃滤液。再加入500 μL的Buffer P4(这一步的Buffer P4使用前需按说明书加入无水乙醇)，12,000 rpm离心30秒弃滤液。

重复操作一次！！！

再将得到的吸附柱放回收集管中，12,000 rpm离心1分钟弃滤液（这一步空转，不用加入试剂，离心充分。此时只要留下吸附柱，将收集管可丢弃)。

将吸附柱置于新离心管（这个离心管的标记一定要全面，载体种类名字最好写全，日期这些标记清楚，因为可以放很久，后面可以对应上）中，向膜中央悬空加入30-100 μL的Eluiton Buffer，室温静置1-2分钟后，12,000 rpm离心1分钟收集洗脱液。(这一步的Eluiton Buffer可以预热，并且可以将离心管中收集的质粒液体再重新打入膜中央，再次重新操作一次，这样可以提高洗脱效率，质粒收集的更彻底！！！）

步骤五：检测与储存

操作：在2楼的分光光度计，因为是载体质粒，所以应该选的选项是双链DNA哦！！！然后就要挨个检测浓度，最好标记在管壁上，这样后面酶切的时候可以直接计算，并且浓度哪管有问题的话也可以知晓，不至于酶切时候发现该管质粒浓度浓度过低导致实验用量不够。