需要提前准备的工作：

研磨机预冷负五十度，水浴锅开至65度（毕竟耗费时间，所以最好是实验前打开仪器）

我需要的是小孢子来做，因为后面需要跑定量，所以是将之前的样品空白和实验各自做了俩管，样品是某管样品随机取样，但是肯定是各管空白和实验是对应的处理的（需要的是没有开裂的小孢子，开裂的小孢子样品中RNA降解的差不多了）尽量实验样品都放冰上。

Step 1. 组织研磨

俩毫升的无菌无酶管，我每管装了四个小孢子以及一个氧化锆研磨珠，研磨前样品以及装样的研磨24孔那个装置都放液氮里速冻，跑了五个时段，每时段一分钟。磨出来的效果其实差不多了，可能会有个别几个没磨好。（样品取出来后尽量放在冰上，如果样品量过多，就得分批研磨，此时上一批研磨好的样品建议最好放冰上或者放到负二十冰箱里减少降解，我们尝试了磨好的样品放在液氮里来防降解，但是这样造成的后果就是取出来放冰上准备后续步骤时会炸管，这样还得重新去核对再补样，个人觉得可能会更麻烦）。

Step 2. 加入裂解液

向研磨好的组织粉末中迅速加入1 mL已预热至65°C的Buffer PPR1。

Step 3. 混匀

涡旋震荡，（这一步要涡旋挺久久久久的，不用怀疑自己！！！）直至样品完全分散在裂解液中。再放到水浴锅里水水浴十分钟（可以先水浴五分钟，拿出来摇晃混匀一下再水浴五分钟）。

Step 4. 离心，加入乙醇

随后12000rpm离心5min，再吸900ul上清到俩毫升离心管中，向匀浆裂解物中加入450 μL无水乙醇，用移液器充分吹打混匀。(首先这步离心出来的样品是会呈三层分层状，我们需要的上清是中间那层，移液枪可以抵着上层腻乎状下去吸上清，然后450ul的乙醇可以在前面等待的时间内先打入到离心管中，这样节省点时间。最后管内如果有白色絮状的的物质可以用移液枪的枪头扒拉出来。这样放着后面可能会堵住吸附柱）。

Step 5. 过柱（除gDNA）

将混合物全部转移至基因组DNA清除柱中。再12000rpm离心1min（这一步需要注意的是首先这个柱子一定不能弄错，因为试剂盒内有俩种柱子，这一步务必是清除柱，其次我们的样品现在量大于1ml的，这个柱子一次只可以加入750ul的溶液,所以需要先加入750ul，去离心，然后再将剩余的全部加入进去，再去离心。这里建议第一次离心时候将收集管中液体丢弃，然后再加第二次需要离心的！！！因为我们出现了第二次离心后柱内的液体没有过柱，仍在里面，也怀疑了会不会柱子堵塞，但是下面收集管液体很满，所以判断可能太多，尝试将第一次离心的液体丢弃后再次离心就已经解决了这个问题）。

Step 6. 结合RNA

将清除柱转移至一个新的2ml无RNase离心管中。加入500 μL Buffer PPR2，12,000 rpm离心1分钟，留溶液，再往离心管里加入250 μL无水乙醇，吹打混匀。全部转移至HiPure RNA吸附柱（试剂盒内另一种柱子）中。12,000 rpm离心1分钟，弃废液。（此时这步可以俩个人配合，因为前面清除柱的标签和吸附柱上面的标签都挨个对上，我们是一个加乙醇吹打交给另一个转移到对应吸附柱上）

Step 7. 去除杂质

向吸附柱中加入700 μL Buffer RWA。室温放置1min，12,000 rpm离心60秒，弃废液。

Step 8. 第一次洗涤

向吸附柱中加入500 μL Buffer RWB（使用前请确认已按说明书加入无水乙醇）。12,000 rpm离心30秒，弃废液。

Step 9. 第二次洗涤

重复Step 8，用500 μL Buffer RWB再洗涤一次。丢弃废液

Step 10. 空离干燥

将吸附柱放回收集管，12,000 rpm空离1分钟，以彻底去除残留乙醇。

Step 11. 洗脱准备

将吸附柱置于一个新的无RNase 1.5 mL离心中。（试剂盒内也会提供，但是这个管子的标记一定要写全，并且需要很清楚，后面用的时候可用分清楚）。

Step 12. 洗脱RNA

向吸附膜中央悬空加入30 μL RNA Elution Buffer。室温静置1-2分钟，12,000 rpm离心1分钟，管底液体即为洗脱的总RNA。（这一步的Eluiton Buffer可以预热，并且可以将离心管中收集的液体再重新打入膜中央，再次重新操作一次，这样可以提高洗脱效率，收集的更彻底！！！）

收集好的RNA一般放置于负八十冰箱保存！！！