https://www.kdocs.cn/l/ctiT2knRtvSf

PCR反应体系配制（25 μL体系）

2× Pro Mix 12.5ul

上游引物 1.0ul

下游引物 1.0 ul

模板DNA 1.0ul

无菌水 9.5ul

操作要点：

冰上操作，避免酶失活；

先加Master Mix和水，再加引物和模板，轻轻混匀（短暂离心收集液体）；

如果你和我一样做的也是启动子的引物，那么此处的模版就是香榧的gDNA（CDS序列用的是cDNA）

PCR扩增程序

预变性 95°C 3min

变性 95C°C 15s

退火 Tm-5°C 15s(Tm值是设计引物时决定的)

延伸 72°C 根据基因大小调整30s/kb-60S/kb.（一般1kb设置是1分钟，2kb则需要设置为2分钟）

再延伸 72°C 5min

保温 4°C

一般为35个循环

（二）扩增产物检测（琼脂糖凝胶电泳）

制胶：这个需要大孔的梳子来制。

上样与电泳：

样品：将所有的PCR产物都加入到胶孔中

对照：加入5ul的DNA Marker（需要对应大小的Marker，比如我的就是DL2000）作为分子量标准；

100 V电泳20-30 min（溴酚蓝迁移至凝胶2/3处停止）。

成像：

用凝胶成像系统观察结果，目标条带大小应与预期一致（例：预期500 bp则条带位于Marker 500 bp位置）。

注意！！！！

我是四个基因，但是重复了很多遍。。。。因为启动子的比较难扩，所以如果没有得到想要的条带，通常可以这样解决

1. ：更换模版！去再找别人问问看他们有没有香榧的gDNA，然后再去扩试试
2. ：更换酶！（针对启动子引物来说）如果2× Pro Mix没有扩出来，那么可以尝试prime STAR MAX，如果还没扩增出来，可以用 KOD DNA Polymerase来试试，但是要注意这俩种酶的扩增程序和2× Pro Mix的不一样！！！此外当换成为KOD时，要注意加入的模版应该为5ul，水为5.5ul。
3. ：改变退火温度，需要稍微调整一下，可能上下浮动几度，需要尝试的。
4. ：多重一起尝试同时换吧。。。。。