1.扩增

• 体系（25μL）：模板（cDNA、基因组、质粒）1μL、F（目标序列cDNA编码链）1μL、R 1μL、2×phanta max master mix 12.5μL、ddH₂O 9.5μL

• PCR循环：34×（退火Tm60℃，延伸时间按bp调整）

2.酶切（50μL）

• 体系：质粒（1μg/μL浓度）4.5μL~7μL、双酶切酶5μL、10×Supper color buffer 5μL、ddH₂O补至50μL

• 条件：37℃酶切/培养箱孵育3h；若需彻底酶切可延长，酶切后可70℃失活

3.琼脂糖凝胶电泳（1%）

3.1 凝胶配制

凝胶浓度 琼脂糖 1×TBE 核酸染料

1% 0.30.39g 3035mL 3~3.5μL

• 小胶：30-35mL；中胶：5560mL；大胶：105~110mL

• 一般maker加7μL，胶回收对应切条带

3.2 上样与电泳

• 上样：样品+6×Loading buffer（5:1），maker 5~6μL

• 条件：135V 19~25min；片段＜800bp可缩短时间，2%胶跑80bp片段需25min

4.连接 转化（大肠杆菌）

4.1 连接反应（10μL）

• 体系：目的片段1~3μL、载体（质粒）3μL、连接酶1μL、buffer 2μL、ddH₂O补至10μL

• 条件：37℃ 5min（快速连接）；或16℃连接过夜

4.2 大肠杆菌转化

1. 感受态制备/融化：大肠杆菌DH5α，100μL感受态可分成2份
2. 加样：连接产物5~10μL，冰上30min
3. 热激：42℃ 45s，冰上2min
4. 复苏：加400μL无抗LB，37℃摇1h（200rpm）
5. 涂布：取100-200μL涂含对应抗生素（A⁺/K⁺）LB平板，37℃培养12-16h（大平板培养18~20h）
6. 小摇 大摇

• 小摇：4mL LB+抗生素+单菌落，37℃摇4~5h

• 大摇：4mL LB+抗生素+4μL小摇菌液/1:100接种，37℃摇12~16h

5.菌检（PCR）

5.1 体系（25μL）

• 菌液1μL、F 1μL、R 1μL、Taq 0.75μL、ddH₂O 3.1μL

5.2 程序

• 预变性95℃ 3min；30×循环（退火Tm+3℃）；终延伸72℃ 5min

• 产物电泳验证条带大小

1. 保种

• 菌液400μL + 50%甘油400μL，混匀后-80℃冰箱保存（短期放-20℃）

1. 复苏

• 划线：取保种菌液划线LB+抗生素平板，37℃培养12~16h，挑单菌落扩增

• 直接接种：短期保存菌液直接接种LB+抗生素培养基扩增

1. 农杆菌转化（可在外面做）
2. 体系：1μL质粒+2μL农杆菌感受态（GV3101），冰上5min
3. 冻融/热激：液氮5min→37℃水浴5min→冰上5min；或37℃水浴4min
4. 复苏：加400μL无抗LB，28℃摇2~3h（200rpm）
5. 涂布：涂含Kan+Rif等抗生素LB平板，28℃培养2d
6. 挑单克隆：挑取单菌落进行菌检、扩增

备注

• 酶切时若片段＜80bp，用2%胶；电泳时间根据片段大小调整，短片段缩短时间

• 抗生素浓度根据载体/菌种调整，Amp 50μg/mL、Kan 50μg/mL

• 所有无菌操作需在超净台进行，避免污染