# 报错详细信息

A USER ERROR has occurred: An index is required but was not found for file drivingVariantFile:/home/Raw_data_20250821/Rmolle_callsnp_work/Rmolle_all_results/8snp_index_filter/SNP.raw.chr14.401.vcf.gz. Support for unindexed block-compressed files has been temporarily disabled. Try running IndexFeatureFile on the input.

# 解决

• 该错误表明正在处理的 .vcf.gz压缩VCF文件缺少索引文件（通常为 .tbi或 .csi），而GATK要求必须提供索引才能读取压缩的块文件（block-compressed files）。
• 首先，确定是否未将索引文件一起复制到工作目录中，如果是该情况，复制后则解决。

• 如果不生效或者没有索引文件，则按照以下步骤重新生成：

01 需要准备的文件

1. gff文件（如果有的话，最好是gtf文件，gtf文件格式更严谨）
2. 基因组文件
3. vcf文件

02  利用annovar进行SNP注释

（1）准备基因组文件构建数据库

• 下载gffread：将gff文件转化为gtf文件

  # 版本为为gffread v0.12.8
  git clone https://github.com/gpertea/gffread
  cd gffread
  make release

• 将gff文件转换为gtf文件

  # gff转换为gtf
  gffread Rmolle_genomic_GCA_025413875.1.gff -T -o Rmolle.gtf

• 将gtf文件转成refGene格式

 01 将分染色体的vcf文件合并成全基因组vcf文件

1. 首先，生成vcf列表文件：

ls INDEL.raw.chr*.vcf.gz > INDEX_raw_all_vcf.list
ls SNP.raw.chr*.vcf.gz > SNP_raw_all_vcf.list
# 如果有叶绿体等染色体，手动删除

2.  使用gatk合并vcf文件

gatk \
  --java-options "-Xmx10g -Djava.io.tmpdir=./tmp" \
  MergeVcfs \
  -I raw_vcf.list \
  -O all.merge_raw.vcf

02 过滤变异

gatk官网在2025年更新了Hard Filter的标准，选择最新的标准进行筛选：

 01 使用CombineGVCFs合并所有样本的gVCF文件

分染色体合并：

# 生成单个样本的gVCF文件

# HaplotypeCaller最多可以设置4个线程，由于Java限制再增加也没有用 
gatk --java-options "-Xmx10g -XX:ParallelGCThreads=4" HaplotypeCaller -R genome.fasta -I sample1.pe.sort.markdup.bam -ERC GVCF -O sample1.g.vcf.gz

# 利用gatk生成每个样本的gVCF文件时，报错

• 具体的报错信息：

# 比对结果统计

在利用bwa mapping获得bam文件后，可以利用samtools对比对的结果进行统计。

# 统计每个样本的整体比对率(primary mapped)和双末端比对(properly paired)
samtools flagstat sample.bam 

# 统计每个样本的覆盖情况（coverage）和平均测序深度（meandepth）
samtools coverage sample.bam 
# 但要注意的是 coverage 参数在低版本的里面是没有的（如1.6），需要使用较新的版本的samtools，如1.21。

# 比对时候的注意事项

• 在核基因组的SNP分析中，如果参考基因组里面组装了叶绿体基因组，则会影响最后比对结果的统计。
• 首先，叶绿体基因组通常没有重复序列且基因密度高，reads比对到叶绿体的成功率很高，会虚高整体比对率。
• 其次，叶绿体的超高深度会严重拉高平均深度。
• 因此，在比对的时候，最好先将染色体序列单独提取出来，进行比对。